RP3: Modellierung in IPS Zellen

• Das Reprogrammieren von somatischen Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) ist zu einer etablierten Technik geworden, um sich selbst-erneuernde pluripotente Stammzellen für innovative Krankheitsmodelle zu generieren.
• Die Generierung stoffwechselaktiver, polarisierter Hepatozyten-artiger Zellen aus solchen iPS stellt jedoch weiterhin eine Herausforderung dar. Einige fortgeschrittene Strategien zur hepatischen Differenzierung basieren auf dreidimensionalen Aggregaten oder auf Suspensionskultur-basierenden Bioreaktorsystemen, die dazu führen, dass Leberzellen im Vergleich zu zweidimensionalen Differenzierungssystemen einen reiferen Phänotyp aufweisen.
• Mit unseren Zellkultur-Methoden können wir 3D-Leber-Organoide aus iPS züchten, die hepatobiliäre Transporter wie ABCC2 (MRP2) und OATP2B1 in der apikalen bzw. basolateralen Membrandomäne der Leberzellen aufweisen.
• Für eine punktgenaue Korrektur der Cholestase-assoziierten Genmutationen haben wir verschiedene CRISPR/Cas9-Systeme etabliert. Das „Prime Editing“-Verfahren kann dabei mit der Lotsen-RNA noch eine verlängerte Sequenz in die Zellen einbringen, die als Blaupause während der DNA-Reparatur dient. Damit können ideale Kontrollzellen generiert werden, um den Einfluss bestimmter Genmutationen präzise von Effekten anderer Faktoren abgrenzen zu können.

Wissenschaftliche Publikationen:

Scientific Reports A selectable all-in-one CRISPR prime editing piggyBac transposon allows for highly efficient gene editing in human cell lines. von R. Eggenschwiler et al.

Liver International "Extrahepatic manifestations of progressive familial intrahepatic cholestasis syndromes: presentation of a case series and literature review" von Eva-Doreen Pfister et al. Joint activity of RP1, RP2b, RP3, CR

The Journal of Pediatrics "KIF12 Variants and Disturbed Hepatocyte Polarity in Children with a Phenotypic Spectrum of Cholestatic Liver Disease" von Amelie Stalke et al. Joint activity of RP1, RP3, CR

Cells Synthetic Notch-Receptor-Mediated Transmission of a Transient Signal into Permanent Information via CRISPR/Cas9-Based Genome Editing von M. Sgodda et al.

(A) Sendai-Virus-basierte Reprogrammierungssysteme wurden eingesetzt, um iPS-Zellen (positiv für Oct4, Nanog, SSEA4, Sox2, TRA1-60) aus CD34⁺-Zellen aus dem peripheren Blut von Patienten zu erzeugen, die Mutationen in BSEP, MDR3 und MYO5B aufweisen.
(B) Organoid-basierte Differenzierungs-Verfahren wurden auf der Grundlage einer fein abgestimmten Endoderm-Induktion (C-KIT⁺/CXCR4⁺ Population) etabliert, was zu einer verbesserten Ausreifung der hepatischen Zellen führte und mittels Analyse der Genexpressionsprofile bestätigt werden konnte.
(C) Immunfluoreszenz-Analysen zeigen eine diffuse Fehllokalisierung der eigentlich apikal lokalisierten Exportpumpe MRP2 in einer MYO5B-mutierten Leberprobe eines PFIC-Patienten. iPS-abgeleitete Organoide des betreffenden Patienten wiesen nicht nur eine reduzierte Organoidgröße auf, was auf eine gestörte Leberfunktion hinweist, sondern zeigten ebenfalls eine diffuse Fehllokalisierung von MRP2.
(D) Die funktionelle Charakterisierung des MRP2-vermittelten Transports von Cholyl-Lysyl-Fluorescein (CLF) zeigte eine deutliche Verringerung des CLF-Transports in MYO5B^mut-Organoiden im Vergleich zu unbeeinträchtigten Organoiden (HiChol). Als weitere Kontrolle für unspezifische Effekte wurde der CLF-Transport durch 100µM Cyclosporin A blockiert.